УДК577.127.3.: 616.036.12.

ВЛИЯНИЕ ПИЩЕВЫХ ДОБАВОК ИЗ БИОМАССЫ
РАЗНЫХ ШТАММОВ СПИРУЛИНЫ НА ПОКАЗАТЕЛИ
СИСТЕМЫ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ КРЫС
ПРИ ФЕНИЛГИДРАЗИНОВОЙ АНЕМИИ

Л.М. Карпов, С.Г. Каракис, О.Н. Ершова, Е.Г. Драгоева,
Т.И. Лавренюк, А.В. Клименко, В.А. Сагариц, Т.В. Гладкий,
Т.В. Коломийчук, Т.В. Бузыка, О.В. Денисенко, Г.Н. Крюкова

Одесский национальный университет им. И.И. Мечникова

Содержание малонового диальдегида (МДА), глутатиона восстановленного (ГВ) и глутатионредуктазная активность (ГР- активность) были изучены в органах (печень, почки, сердце, мозг) и эритроцитах белых крыс в модели фенилгидразиновой анемии с использованием пищевых добавок из биомассы разных штаммов спирулины. Выявлено, что фенилгидразиновая анемия у крыс протекает с развитием оксидативного стресса. В изученных органах и эритроцитах анемичных животных на фоне увеличения содержания МДА наблюдали повышение ГР-активности и снижение содержания ГВ, что свидетельствует о задействовании глутатионовой защиты при этой патологии. Установлено, что пищевые добавки спирулины штаммов 198В и 27G оказывают антиоксидантное действие как путем защиты изученных систем от действия свободных радикалов, так и путем увеличения синтеза ГВ в них и способствуют быстрейшей нормализации показателей антиоксидантной защиты в органах и эритроцитах животных с фенилгидразиновой анемией.

В настоящее время в связи с ухудшением экологической ситуации наблюдается усиление тенденции поиска новых препаратов с антиоксидантным действием, особенно природного происхождения. Среди природных биологически активных препаратов внимание исследователей привлекает биомасса сине-зеленой водоросли Spirulina platensis, широко используемая в качестве пищевой добавки и обладающая выраженным антиоксидантным действием. На фоне приема биомассы спирулины при ряде патологий и действии неблагоприятных патогенных и экстремальных факторов (отравление тяжелыми металлами, воздействие радиации, почечная недостаточность под действием гентамицина, старение, химически индуцированная генотоксичность и др.) отмечено снижение перекисного окисления липидов в органах и тканях и усиление системы антиоксидантной защиты [1-7]. Установлено, что антиоксидантное действие спирулины обусловлено содержащимися в ее биомассе фикобилипротеинами (с- фикоцианин и аллофикоцианин), β-каротином, фенольными кислотами, токоферолами, сульфатированными полисахаридами [7, 8]. В ряде работ показано, что основным антиоксидантом является фикобилипротеин с-фикоцианин [9]. С-фикоцианин способен обезвреживать алкоксильные, гидроксильные, пероксильные радикалы, в частности, с-фикоцианин защищает от лизиса эритроциты человеческой крови под воздействием пероксильных радикалов [10, 11]. Дальнейшие исследования показали, что ковалентно связанный с субъединицами белка тетрапиррольный хромофор фикоцианобилин обеспечивает способность с-фикоцианина обезвреживать радикалы [12].

Ранее, мы сообщали о полученных нами штаммах цианобактерии Spirulina platensis 198В и 27G, отличающихся от исходного родительского штамма дикого типа, повышенным содержанием компонентов, обладающих антиоксидантным действием: серусодержащих аминокислот и фенилаланина, а также пигментов – с-фикоцианина, аллофикоцианина и хлорофилла а, а штамм 198В – еще и с повышенным содержанием каротиноидов [13]. Нами было сделано предположение, что биомасса мутантных штаммов 198В и 27G обладает более сильным антиоксидантным действием, чем традиционно используемая биомасса штамма дикого типа.

Анемия, развивающаяся в результате введения лабораторным животным гемолитического яда фенилгидразина (ФГ), сопровождается сильным оксидативным стрессом [14] и может служить адекватной моделью для апробации препаратов с антиоксидантным действием.

Цель данной работы – провести сравнительное изучение влияния препаратов биомассы сине-зеленой водоросли Spirulina planensis штамма дикого типа и его мутантов 198В и 27G при использовании их в качестве пищевой добавки на содержание малонового диальдегида (МДА), глутатиона восстановленного (ГВ) и глутатионредуктазную активность (ГР-активность) в печени, почках, сердце, мозге и эритроцитах белых крыс в модели фенилгидразиновой анемии.

Материалы и методы. Эксперимент проводили на 40 самцах белых беспородных крыс весом 180 – 220 г., разделенных на 5 групп (табл. 1) по 8 особей: 1 группа – интактные животные; 2 группа – животные с моделью фенилгидразиновой анемии; 3, 4, и 5 группы – животные с моделью фенилгидразиновой анемии, принимавшие в качестве пищевой добавки препараты биомассы разных штаммов сине-зеленой водоросли Spirulina platensis (дикого типа, 198В и 27G, соответственно). Гемолитическую анемию моделировали путем внутримышечной инъекции фенилгидразина (20 мг/кг массы животных) в течение 4 дней [15, 16]. Препараты спирулины (по 250 мг сухой биомассы/кг массы животных) вводили внутрижелудочно с помощью зонда в виде водной суспензии в объеме 2 мл начиная со второго дня после начала введения фенилгидразина. Пятые сутки от начала введения фенилгидразина считались первым днем сформированной гемолитической анемии. Показатели состояния системы антиоксидантной защиты определяли в печени, почках, мозге, сердце и эритроцитах животных на 5 день (3 крысы из каждой группы) и на 33 день (5 крыс из каждой группы) от начала эксперимента. Животных декапитировали. Гомогенаты органов готовили как описанно в [17]. Гемолизат эритроцитов готовили как описано в [18].

Содержание МДА определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты, как описано в [19]. Содержание ВГ в гомогенатах определяли в реакции его взаимодействия с реактивом Элмана с образованием окрашенного продукта 2-нитро-6-меркаптобензойной кислоты, имеющем максимум поглощения при λ=412 [18].

Глутатионредуктазную активность (КФ 1.6.4.2) определяли измеряя скорость окисления восстановленного НАДФ в реакционной среде (100 мМ К-Na-фосфатный буфер, рН6,6; 0,075мМ глутатион окисленный, 0,0626 мМ НАДФН2, ферментный препарат). Реакцию инициировали окисленным глутатионом. Динамику убыли НАДФН₂ регистрировали в течение 5 мин при λ=340. Расчет активности производили, как описано в [17].

Результаты исследования и их обсуждение. Введение животным ФГ на 5 сутки эксперимента приводит к увеличению содержания МДА в печени, мозге, сердце, и эритроцитах этих животных в 2, 3; 3,5 и 8,5 раз, соответственно (рис. 1), что свидетельствует об интенсификации свободно-радикальных процессов в них. Согласно данным литературы, основной мишенью действия ФГ на молекулярном уровне является гемоглобин. Известно, что в процессе взаимодействия оксигемоглобина с ФГ происходит оксидация ФГ с образованием многих низкомолекулярных активных форм кислорода (пероксид водорода, супероксидный радикал, бензен, нитроген) и радикальных производных ФГ и метгемоглобина. Под влиянием этих активных продуктов происходит модификация гема в метгемоглобине. В эритроцитах появляются производные метгемоглобина, содержащие N- фенилпротопорфирин [14]. Индуцированные ФГ процессы дестабилизируют глобиновую часть гемоглобина, что приводит к ее денатурации и преципитации и высвобождению гема, который, в свою очередь, является сильным прооксидантом [20]. Очевидно, развитие этих свободно-радикальных процессов в эритроцитах и является причиной столь резкого увеличения содержания МДА в них. С током крови гем, активные метаболиты кислорода и ФГ попадают в органы животных и также вызывают в них активизацию процессов свободно-радикального окисления, что отражается в повышении содержания МДА в них. Следует отметить, что на фоне повышения содержания МДА в печени, сердце и мозге животных на стадии сформированной анемии (5 сутки эксперимента) этот показатель оставался нормальным в почках.

Рисунок 1. Изменения содержаниия малонового диальдегида (% от соответствующих значений в интактной группе) в органах и эритроцитах белых крыс при моделировании гемолитической анемии.

Изучение содержания ГВ и ГР-активности в органах и эритроцитах экспериментальных животных (рис. 2 и 3) показало, что на стадии острой анемии (5 сутки) содержание ГВ в ряде органов снижается (почки, сердце, мозг), а ГР-активность повышается (печень, почки, сердце, мозг), в эритроцитах – содержание ГВ и ГР-активность остаются на уровне нормы. Эти данные свидетельствуют о том, что глутатионовая защита играет важную роль в почках печени, сердце и мозге в противостоянии организма процессам свободно-радикального окисления, имеющих место при фенилгидразиновом токсикозе. Особенно эффективно эта защита проявляет себя в почках – она полностью нейтрализует действие гиперпродукции свободных радикалов и содержание МДА остается на уровне нормы. В эритроцитах экспериментальных животных на стадии острой анемии на фоне многократного увеличения содержания МДА (в 8 раз) содержание ГВ и ГР- активность не отличаются от аналогичных показателей в интактной группе.

Рис. 2. Содержание глутатиона восстановленного (% от соответствующих значений в интактной группе) в органах и эритроцитах белых крыс при моделировании гемолитической анемии.

Рис.3. Глутатионредуктазная активность (% от соответствующих значений в интактной группе) в органах и эритроцитах белых крыс при моделировании гемолитической анемии.

Можно предположить, что в эритроцитах анемичных животных на этой стадии болезни работают другие механизмы защиты.

Прием пищевой добавки спирулины дикого типа на стадии острой анемии не приводил к снижению содержания МДА в изученных органах анемичных животных (группа 3), а, даже, способствовал усилению перекисного окисления липидов в сердце и мозге, в то время как, прием пищевых добавок спирулины 198В и 27G (группы 4 и 5) приводил к уменьшению накопления МДА в печени, сердце и эритроцитах по сравнению с контрольными животными (2 группа). Особенно значительные отличия в содержании МДА наблюдали в эритроцитах под влиянием спирулины 27G – этот показатель понижался в 3 раза. Наблюдаемое антирадикальное защитное действие пищевых добавок спирулины 198В и 27G можно объяснить тем, что в них, по сравнению со спирулиной дикого типа, повышено содержание фикобилипротеинов с-фикоцианина и аллофикоцианина. Возможно, попадая в кровь, фикобилины этих фикобилипротеинов, содержащие в своем составе, как и гемоглобин, порфириновые кольца, могут служить мишенями для действия ФГ, ослабляя таким образом действие ФГ на оксигемоглобин, а также способны нейтрализовать активные кислородные метаболиты.

Учитывая тот факт, что пероксидация липидов мембран эритроцитов приводит к гемолизу эритроцитов, полученные нами данные согласуются с выводами, изложенными в работе [16], о повышенной устойчивости эритроцитов к гемолизу у животных с развитой фенилгидразиновой анемией, получавшим в качестве пищевой добавки спирулину 27G. Косвенными доказательствами участия пищевых добавок спирулины штаммов 198В и 27G в детоксикации ФГ и его метаболитов являются также наблюдаемые нами факты повышения содержания ГВ в эритроцитах (на 40%) и снижение содержания ГВ в печени (в 5 раз) животных 4 и 5 групп по сравнению с животными 2 группы. Можно предположить, что метаболиты пищевых добавок в эритроцитах, подвергнутых действию ФГ, способны выполнять функцию ГВ по обезвреживанию свободных радикалов и усиливают выведение токсических продуктов метаболизма ФГ из крови через печень.

В процессе выздоровления анемичных животных имеет место тенденция снижения содержания МДА в печени, сердце мозге и эритроцитах. Однако, на 33 сутки эксперимента, только в эритроцитах показания содержания МДА достигают нормы. В почках, наоборот, наблюдается тенденция увеличения содержания МДА. На фоне повышенного содержания МДА в исследованных органах животных 2 группы наблюдали повышенную активность ГР, а в почках и мозге – также активное потребление ГВ. Это свидетельствует о том, что в органах этих животных еще имеет место повышенное образование свободных радикалов и что глутатионовая защита у этих животных еще находится в состоянии повышенной активности. Несмотря на то, что по ряду показателей крови (количество эритроцитов и гемоглобина, морфологические показатели эритроцитов, содержание МДА в эритроцитах), животные, подвергнутые действию ФГ не отличаются от интактных, их организм еще справляется с последствиями токсикоза.

Прием пищевой добавки спирулины дикого типа анемичными животными (3 группа) на этой стадии эксперимента не оказывал существенного влияния на содержание МДА, ГВ и ГР-активность в почках, сердце, мозге и эритроцитах этих животных. Наблюдаемое увеличение (в 2 раза) содержания МДА в печени животных 3 группы свидетельствует об усилении детоксикации продуктов метаболизма ФГ на этой стадии болезни под влиянием спирулины ДТ.

У животных 4 и 5 групп, принимавших спирулину 198В и 27G, в отличие от животных 2 группы, не примавших пищевые добавки, на 33 сутки эксперимента наблюдали нормализацию содержания МДА в почках и мозге, а у животных 5 группы – также и в печени, а также более сильное его снижение в сердце и эритроцитах (даже ниже нормы). При этом, содержание ГВ в сердце и эритроцитах этих животных было на уровне интактных животных, в печени – даже на 37-53% выше, чем у интактных животных а в почках – выше, чем у животных 2 группы. Кроме того, наблюдали нормальную ГР-активность в мозге и эритроцитах, а также более сильную тенденцию к нормализации ГР-активности в почках, чем у животных 2 группы. В печени животных 4 группы ГР-активность достигала нормы.

Таким образом, у животных, принимавших пищевые добавки спирулины 198В и 27G тенденции восстановления нормального равновесия между скоростью свободнорадикального окисления и активностью антиоксидантной системы выражены более сильно, чем у животных не принимавших эти пищевые добавки. На основе анализа полученных нами данных, можно предположить, что метаболиты пищевых добавок участвуют непосредственно в обезвреживании свободных радикалов, а также способствуют повышенному синтезу глутатиона. Возможно, способность этих пищевых добавок вызывать сверхсинтез глутатиона связана с повышенным содержанием серусодержащих аминокислот в их биомассе.

Выводы

1. Фенилгидразиновая анемия у белых крыс сопровождается развитием оксидативного стресса в печени, мозге, сердце и, особенно, в эритроцитах.

2. Глутатион восстановленный и глутатионредуктаза (глутатионовая защита) являются важными элементами защиты от оксидативного стресса при фенилгидразиновой анемии у белых крыс.

3. Прием пищевых добавок спирулины штаммов 198В и 27G приводит к ускорению нормализации показателей антиоксидантной защиты, оказывая антирадикальное защитное действие и способствуя повышенному накоплению глутатиона восстановленного в эритроцитах и органах животных с фенилгидразиновой анемией.

Литература

1. Upasani C. D., Balaraman R. Protective effect of Spirulina on lead induced deleterious changes in the lipid peroxidation and endogenous antioxidants in rats // Phytother Res. – 2003. – Vol. 17(4). – P. 330-334.

2. Gemma C., Mersches M. N., Sepesi B., Choo K., Holmes D. B., Bickford P. C. Diets enriched in foods with high antioxidant activity reverse age-induced in cerebellar beta-adrenergic function and increases in proinflammatory cytokines // J Neurosci. – 2002. – Vol.22(14). – P. 6114-61120.

3. Premkumar K., Pachiappan A., Abraham S. K., Santhiya S. T., Gopinath P. M., Ramesh A. Effect of Spirulina fusiformis on cyclophosphamide and mitomycin-C induced genotoxicity and oxidative stress in mice // Fitoterapia. – 2001. – Vol. 72(8). – P. 906-911.

4. Kuhad A., Tirkey N., Pilkhwal S., Chopra K. Effect of Spirulina, a blue green algae, on gentamicin-induced oxidative stress and renal dysfunction in rats // Fundam Clin Pharmacol. – 2006. – Vol. 20(2). – P. 121-128.

5. Горбань Є. М., Топольникова Н. В., Вплив препарату спіруліни на ендокринний статус та систему перекисного окиснення ліпідів опромінених щурів // Українский Радіологічний Журнал. – 2003. – Т. 11. С. 83-86.

6. Горбань Е. Н., Юрженко Н. Н., Брюзгина Т. С., Купраш Л. П., Донцова Л. Н. Антиоксидантные свойства спирулины // Вестник гигиены и эпидемиологии. – 2002. – Т. 6, №1. – С.

7.Miranda M. S., Cintra R. C., Barros S. B., Mancini Filho J. Antioxidant activity of the microalgae Spirulina maxima // Braz J Med Biol Res. – 1998. – Vol. 31(8). – P. 1075-1079.

8. Овсянникова Т. Н., Миронова Н. Г., Заболотный В. Н., Губанова А. Г., Полищук Л. Я., Виноградова Г. Ю., Забелина И. А., Карпенко Н. А. Состав и антиоксидантная активность комплекса биополимеров из Spirulina platensis (Nordst.) Geitl. // Альгология. – 1998. – Т.8, №1. – С. 75-81.

9. Pinero Estrado J. E., Bermejo Bescos P., Villar del Frasno A. M. Antioxidant activity of different fractions of Spirulina platensis protean extract // Farmaco. – 2001. – Vol. 56(5-7). – P. 497-500.

10. Romay Ch., Gonzalez R., Ledon N., Remirez D., Rimbau V. C-phycocyanin: a biliprotein with antioxidant, anti-inflammatory and neuroprotective effects // Curr Protein Pept Sci. – 2003. – Vol. 4(3). – P. 207-216.

11. Romay C., Gonzalez R. Phycocyanin is an antioxidant protector of human erythrocytes against lysis by peroxyl rasicals // J Pharm Pharmacol. – 2000. – Vol. 52(4). – P. 367-368.

12. Patel A., Mishra S., Ghosh P. K. Antioxidant potential of C-phycocyanin isolated from cyanobacterial species Lyngbya, Phormidium and Spirulina spp. // Indian J Biochem Biophys. – 2006. – Vol. 43(1). – P. 25-31.

13. Каракис С. Г., Карпов Л. М., Драгоева Е. Г., Лавренюк Т. И., Сагариц В. А., Марченко В. С. Биохимический состав биомассы штаммов Arthrospira (Spirulina) platensis // Мікробіологія і біотехнологія. – 2008. - №1(2). – С. 58-63.

14. Martin D. Shetlar and H. Allen O. Hill. Reactions of hemoglobin with phenylhydrozine: a review of selected aspects // Environmental Health Perspectives. – 1985. – Vol. 64. – P. 265-281.

15. Болезни системы крови. – М.: Мед пресс-информ, 2004. – 424 с.

16. Гладкій Т. В., Коломійчук Т. В., Сьомік Л. І., Карпов Л. М., Павліченко О. Д., Бузика Т. В. Морфологічні показники еритроцитів щурів за штучної гемолітичної анемії на фоні застосування водорості Spirulina platensis у якості харчової добавки // Вісник ОНУ. – 2006. – Том 11. – випуск 6. – С. 249-257.

17. Методы биохимических исследований (липидный и энергетический обмен). Учеб. пособие под ред. М. И. Прохоровой. – Л.: Изд-во Ленинградского ун-та, 1982. – С. 30-31, 163-164, 181-183.

18. Горячковский А. М. Клиническая биохимия. 2-е изд. – Одесса.: Астропринт, 1998. – С. 367, 370-372.

19. Стальная Д.И., Гаришвили Т. Г. Метод определения малонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Сб. Современные методы в биохимии. – М.: Медицина, 1977. – С. 66-68.

20. Калиман П.А., Баранник Т. В. Метаболизм гема и оксидативный стресс // Укр. биохим. журн. – 2001. – Том 73, №1. – С. 5-15.

Карпов Л.М., Каракіс С.Г., Єршова О.М., Драгоєва О.Г., Лавренюк Т.І., Клименко А.В., Сагаріц В.А., Гладкій Т.В., Коломійчук Т.В., Бузика Т.В., Денисенко О. В., Крюкова Г.М. Вплив харчових добавок з біомаси різних штамів спіруліни на показники системи антиоксидантного захисту у щурів за фенілгідразинової анемії

Вміст малонового діальдегіду (МДА), глутатіону відновленого (ГВ) та глутатіонредуктазна активність (ГР-активність) були вивчені в органах (печінка,нирки, серце, мозок) та еритроцитах білих щурів у моделі фенілгідразинової анемії з використанням харчових добавок із біомаси різних штамів спіруліни. Виявлено, що феніл-гідразинова анемія у щурів відбувається з розвитком оксидативного стресу. У вивчених органах і ерітроцитах анемічних тварин на фоні збільшення вмісту МДА спостерігали підвищення ГР-активності і зниження вмісту ГВ, що свідчить про залучення глутатіонового захисту при цій патології. Встановлено, що харчові добавки спіруліни штамів 198В та 27G виявляють антиоксидантну дію як шляхом захисту від вільних радикалів, так і шляхом додаткового синтезу ГВ та сприяють прискореній нормалізації показників антиоксидантного захисту в органах і еритроцитах тварин з фенілгідразиновою анемією.

Karpov L.M., Karakis S.G., Ershova O.N., Dragoeva E.G., Lavrenyuk T.I., Klimenko A.V., Sagarits V.A., Gladkiy T.V., Kolomiychuk T.V., Buzyka T.V., Denisenko O.V., Kryukova G.N. The influence of food supplements from biomass of different spirulina strains on characteristics of antioxidative protection system of rats during phenylhydrazine anemia

The contents of malondialdehyde (MDA), reduced glutathione (GSH) and glutathione reductase (GR) activity were investigated in organs and erythrocytes of white rats in the model of phenylhydrazine anemia either with or without using food supplements from the biomass off different spirulina strains. It is reveal, that phenylhydrazine anemia proceeds with evolution of oxidative stress. Increased of GR-activity and decreased of GSH content have been observed on the phone of elevated content of MDA, what is the evidence of equipping glutathione protection of this pathology. It is determined, that food supplements of spirulina 198B and 27G strains have antioxidant effect either by protecting from free radicals or by increasing of synthesis of GSH and promote the moss quickly normalization of antioxidative rates in organs and erythrocytes of animals with anemia.